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Los Jefes son enemigos muy fuertes encontrados en las Boss Rooms al final del suelo. Los jefes deben ser derrotados para avanzar a otros suelos. En capítulos avanzados, los jefes pueden aparecer como enemigos normales. Esto empieza en The Caves, cuando los Gurglings son encontrados con frecuencia. El jefe para un suelo particular es elegido desde una pool de jefes para el entorno del suelo. Los jefes pueden aparecer como campeones, a los cuales les pueden cambiar varios atributos tales como vida, daño y patrón de ataque. Al derrotarlos, la mayoría de los jefes soltarán un objeto de la Item Pool.

Los jefes suelen resistir efectos de estado. Por ejemplo, la Night Light no los puede ralentizar.

Adicionalmente, algunos suelos pueden tener una sala con un Minijefe.

Capítulo 1Editar

The BasementEditar

Monstro Gemini (jefe) Larry Jr.
Monstro Gemini Larry Jr.
Dingle Gurglings Steven (jefe)
Dingle Gurglings Steven

The CellarEditar

Pin Widow Blighted Ovum
Pin Widow Blighted Ovum
Fistula Gurdy Jr. The Haunt
Fistula Gurdy Jr. The Haunt

The Basement y The CellarEditar

The Duke of Flies Famine Rag Man
The Duke of Flies Famine Rag Man DLC
Little Horn Dangle Turdlings
Little Horn DLC Dangle DLC Turdlings DLC

Burning Basement Editar

Rag Man Little Horn
Rag Man DLC Little Horn DLC
Dangle Turdlings
Dangle DLC Turdlings DLC

Capítulo 2Editar

The CavesEditar

Chub Gurdy Mega Maw
Chub Gurdy Mega Maw
Mega Fatty C.H.A.D. Rag Mega
Mega Fatty C.H.A.D. Rag Mega DLC+

The CatacombsEditar

The Hollow The Husk Dark One
The Hollow The Husk Dark One
Polycephalus Carrion Queen The Wretched
Polycephalus Carrion Queen The Wretched

The Caves y The CatacombsEditar

Peep Gurdy Jr. Pestilence
Peep Gurdy Jr. Pestilence
The Frail The Stain The Forsaken
The Frail The Stain The Forsaken
Big Horn
Big Horn DLC+

Double TroubleEditar

Dingle The Duke of Flies Gemini (jefe)
Dingle The Duke of Flies Gemini
Widow Pin Polycephalus
Widow Pin Polycephalus
Larry Jr. Blighted Ovum Monstro
Larry Jr. Blighted Ovum Monstro

Flooded Caves DLCEditar

The Frail The Stain The Forsaken
The Frail DLC The Stain DLC The Forsaken DLC
Big Horn
Big Horn DLC+

Capítulo 3Editar

The Depths IEditar

The Cage Monstro II
The Cage Monstro II
The Gate Gish
The Gate Gish

Necropolis IEditar

The Adversary The Bloat Mask of Infamy
The Adversary The Bloat Mask of Infamy

The Depths I y Necropolis IEditar

Loki War
Loki War
Brownie Sisters Vis
Brownie DLC Sisters Vis DLC+

Double TroubleEditar

Gurdy Jr. The Haunt The Wretched
Gurdy Jr. The Haunt The Wretched
The Husk Peep Mega Fatty
The Husk Peep Mega Fatty
Dark One Mega Maw Larry Jr.
Dark One Mega Maw Larry Jr.
Blighted Ovum
Blighted Ovum

Dank Depths I DLCEditar

Brownie
Brownie

The Depths II, Necropolis II y Dank Depths IIEditar

Mom
Mom

Capítulo 4Editar

The Womb IEditar

Mr. Fred Scolex
Mr. Fred Scolex

Utero IEditar

Mama Gurdy Lokii
Mama Gurdy Lokii

The Womb I y Utero IEditar

Blastocyst The Bloat Daddy Long Legs
Blastocyst The Bloat Daddy Long Legs
Teratoma Triachnid Death
Teratoma Triachnid Death
Conquest
Conquest

Double TroubleEditar

The Cage Gurdy
The Cage Gurdy
The Fallen The Gate
The Fallen The Gate

Scarred Womb I DLCEditar

=The Womb II, Utero II y Scarred Womb IIEditar

Mom's Heart It Lives
Mom's Heart It Lives

Blue Womb DLCEditar

Hush
Hush DLC

Capítulo 5Editar

SheolEditar

Satan
Satan

The CathedralEditar

Isaac (jefe)
Isaac

Capítulo 6Editar

The ChestEditar

Blue Baby (jefe)
???

Dark Room.pngEditar

The Lamb
The Lamb

Puerta doradaEditar

Mega Satan
Mega Satan

The Void DLC+ (Capítulo 7)Editar

Delirium
Delirium DLC+

UniversalEditar

Son jefes que pueden aparecer en los capítulos 1 a 5 y 7, reemplazando a otro jefe de ese entorno.

The Fallen The Headless Horseman
The Fallen The Headless Horseman

Modo GreedEditar

Ultra Greed Ultra Greedier
Ultra Greed Ultra Greedier

MinijefesEditar

Sala del diabloEditar

Krampus
Krampus

Sala de los ángelesEditar

Boss Uriel Boss Gabriel
Uriel Gabriel

Siete pecados capitalesEditar

Envy Gluttony Wrath Pride
Envy Gluttony Wrath Pride
Lust Greed Sloth
Lust Greed Sloth

Siete super pecados capitalesEditar

Super Envy Super Gluttony Super Wrath Super Pride
Super Envy Super Gluttony Super Wrath Super Pride
Super Lust Super Greed Super Sloth
Super Lust Super Greed Super Sloth

OtrosEditar

Ultra Pride
Ultra Pride
Jefes
Capítulo 1 Blighted Ovum • Dingle • The Duke of Flies • Famine • Fistula • Gemini • Gurdy • Gurdy Jr. • Gurglings • The Haunt • Larry Jr. • Monstro • Pin • Steven • Widow
DLCDangle • Little Horn • Rag Man • Turdlings
Capítulo 2 DLC+Big Horn • Carrion Queen • C.H.A.D. • Chub • Dark One • DLCThe Frail • DLCThe Forsaken • Gurdy • Gurdy Jr. • The Hollow • The Husk • Mega Fatty • Mega Maw • Peep • Pestilence • Polycephalus • DLC+Rag Mega • DLCThe Stain • The Wretched
Capítulo 3 The Adversary • The Bloat • DLCBrownie • The BLoat • The Cage • Carrion Queen • The Gate • Gish • Loki • Mask of Infamy • Monstro II • DLC+Sisters Vis • War • The Wretched • Mom
Capítulo 4 Blastocyst • The Bloat • Conquest • Daddy Long Legs • Death • It Lives • Lokii • Mama Gurdy • Mom's Heart • Mr. Fred • Scolex • Teratoma • Triachnid
Capítulos 1 - 4 The Fallen • The Headless Horseman
Blue Womb DLC Hush
Capítulo 5 The Fallen • Isaac • Satan
Capítulo 6 ??? • The Lamb • Satan
Modo Greed Greed Mode IndicatorDLCUltra Greed • Greed Mode IndicatorDLC+Ultra Greedier
The Void DLC+Delirium